酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA或ELASA）是指將可溶性抗原或抗體與聚苯乙烯等固相載體結(jié)合，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性定量檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）是免疫學(xué)中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定原理

1971年，Engvall和Perlmann發(fā)表了用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）定量測(cè)定IgG的文章，使1966年開發(fā)的用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)被用于液體中微量物質(zhì)的檢測(cè)樣品。測(cè)試方法。
這種方法的基本原理是：
①將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體的表面并保持其免疫活性。
②抗原或抗體與某種酶連接，形成酶標(biāo)抗原或抗體，既保留了其免疫活性，又保留了酶的活性。
測(cè)量時(shí)，待測(cè)樣品（其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按照不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物通過(guò)洗滌與其他物質(zhì)分離，與固相載體結(jié)合的酶量與標(biāo)本中被測(cè)物質(zhì)的量成正比。加入酶反應(yīng)的底物后，底物在酶的催化下變成有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物的量與樣品中被測(cè)物質(zhì)的量直接相關(guān)，因此可以根據(jù)其進(jìn)行定性或定量分析。到顏色反應(yīng)的深度。由于酶的催化效率高，可以大大放大反應(yīng)效果，使測(cè)定方法達(dá)到高靈敏度。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定分類

常用的ELISA可分為以下五類：①直接ELISA； ②間接ELISA； ③夾心ELISA； ④競(jìng)爭(zhēng)性ELISA； ⑤競(jìng)爭(zhēng)性抑制ELISA。其他 ELISA 屬于或源自這五種 ELISA 的組合。

1.直接ELISA

其方法是將抗原按一定比例稀釋后包被于固相載體上，然后加入稀釋后的特異性酶標(biāo)抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結(jié)果。直接ELISA的操作非常簡(jiǎn)單，步驟也比較簡(jiǎn)潔，但其應(yīng)用范圍仍然很有限。一個(gè)重要原因是這種ELISA只經(jīng)過(guò)一步信號(hào)放大（酶放大），因此其靈敏度不是很高；另外，其測(cè)定的對(duì)象也很有限，只能測(cè)定酶標(biāo)記的分子。

2. 間接ELISA

間接ELISA與直接ELISA的區(qū)別在于，間接ELISA中非酶標(biāo)抗體與包被抗原結(jié)合，并引入了二抗（即二抗）。二抗是酶標(biāo)的，可以與一抗特異性結(jié)合，最后加入底物顯色并解讀結(jié)果。由于二抗一般為多克隆抗體，一個(gè)一抗分子可以結(jié)合多個(gè)二抗分子，同時(shí)一個(gè)二抗分子可以標(biāo)記多個(gè)酶分子，所以當(dāng)待測(cè)抗體為多克隆抗體時(shí)，信號(hào)經(jīng)過(guò)兩步放大，最終提高了檢測(cè)的靈敏度。此外，由于二抗的制備相對(duì)容易，并且很早就開始商業(yè)化，因此操作人員不需要進(jìn)行一抗的酶標(biāo)記，這大大減少了工作量。在檢測(cè)抗體效價(jià)、血清效價(jià)以及篩選單克隆抗體的過(guò)程中，間接ELISA是一個(gè)非常重要的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。在臨床診斷中，間接ELISA也是檢測(cè)標(biāo)記抗體的重要手段。間接ELISA也是檢測(cè)標(biāo)記抗體的重要手段。間接ELISA也是檢測(cè)標(biāo)記抗體的重要手段。

3. 三明治 ELISA

夾心ELISA一般可分為直接夾心ELISA和間接夾心ELISA兩種。
直接夾心ELISA分為雙抗體夾心ELISA和雙抗原夾心ELISA。
雙抗體夾心ELISA的方法是將一抗（捕獲抗體）包被于固相載體上，封閉后加入待檢測(cè)抗原，孵育后加入二抗（檢測(cè)抗體）。捕獲抗體和檢測(cè)抗體可以是針對(duì)不同表位的兩種單克隆抗體，或者是針對(duì)相同抗原的一種單克隆抗體和一種多克隆抗體，但檢測(cè)抗體需要用酶標(biāo)記。
雙抗原夾心ELISA的原理和操作與雙抗體夾心ELISA基本相同。
對(duì)于雙抗體夾心ELISA，待測(cè)物必須包含兩個(gè)或多個(gè)表位，否則檢測(cè)抗體無(wú)法與待測(cè)抗原結(jié)合。例如，雙抗體夾心ELISA無(wú)法檢測(cè)半抗原和小分子抗原。對(duì)于雙抗原夾心ELISA，操作與間接ELISA基本相同，但使用特異性抗原代替酶標(biāo)二抗，因此特異性比間接法更好。另外，由于間接ELISA中使用的二抗一般只識(shí)別IgG，而雙抗原夾心ELISA中可以檢測(cè)任何類似的免疫球蛋白，因此雙抗原夾心ELISA也比間接ELISA更靈敏。
間接夾心 ELISA 是基于來(lái)自兩個(gè)不同物種的抗體的夾心 ELISA。洗滌后，加入另一種種屬特異性抗體（非酶標(biāo)，作為檢測(cè)抗體），最后加入酶標(biāo)二抗（特異性識(shí)別檢測(cè)抗體），然后加入底物顯色。與直接雙抗夾心ELISA相比，間接夾心ELISA引入了特異性識(shí)別檢測(cè)抗體的酶標(biāo)二抗，相當(dāng)于對(duì)整個(gè)系統(tǒng)的信號(hào)進(jìn)行了一步放大系統(tǒng)，因此最終結(jié)果比直接雙抗體夾心 ELISA 更靈敏。 。同時(shí)，由于間接夾心ELISA中酶標(biāo)二抗只能識(shí)別檢測(cè)抗體，而不是捕獲抗體，系統(tǒng)的特異性也得到了保證。

4. 競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA

該方法首先將特異性抗體吸附在固相載體表面，洗滌后分為兩組：一組加入酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原的混合物；一組加入酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原的混合物。另一組只加入酶標(biāo)抗原，孵育、洗滌后加入底物顯色，兩組底物降解量之差即為待測(cè)定的未知抗原量。用這種方法測(cè)定的抗原只需具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。因此，該方法常用于激素、藥物等小分子抗原的測(cè)定。

5. 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 ELISA

將抗原預(yù)包被于固相載體上，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入稀釋后的待檢測(cè)抗原（或抗體），然后依次加入該抗體對(duì)應(yīng)的特異性抗體和酶標(biāo)二抗。待測(cè)樣品中的抗原（或抗體）與預(yù)制備系統(tǒng)中固相載體上結(jié)合的抗原（或抗體）競(jìng)爭(zhēng)與特定抗體（或固相載體上結(jié)合的抗原）的結(jié)合。洗掉競(jìng)爭(zhēng)性特異性抗體，最后添加底物顯色。最終的顏色結(jié)果與待檢測(cè)的抗原（或抗體）的量成反比。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路及基本步驟

無(wú)論哪種ELISA，其操作均由以下基本操作組成：①將抗原或抗體吸附到固相載體上； ②添加待測(cè)樣品及后續(xù)試劑； ③孵化； ④洗滌并除去游離的未結(jié)合反應(yīng)物； ⑤ 添加酶檢測(cè)底物； ⑥ 結(jié)果解釋。

三明治法

夾心法常用于檢測(cè)大分子抗原。一般操作步驟為：

將特異性抗體固定（包被）在塑料孔板上，完成后洗掉多余的抗體；
添加待測(cè)樣品。如果樣品中含有待測(cè)抗原，它會(huì)與塑料孔板上的抗體特異性結(jié)合；
洗掉多余的待測(cè)樣品，加入另一種對(duì)該抗原特異的一抗，與待測(cè)抗原結(jié)合；
洗掉多余未結(jié)合的一抗，加入酶聯(lián)二抗，與一抗結(jié)合；
洗掉多余的未結(jié)合二抗，加入酶底物使酶顯色，用肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。

間接法

間接方法常用于檢測(cè)抗體。一般操作步驟為：

將已知抗原固定在塑料孔板上，完成后洗去多余的抗原；
添加待測(cè)樣品。如果樣品中含有待測(cè)一抗，它會(huì)與塑料孔板上的抗原特異性結(jié)合；
洗去多余的待測(cè)樣品，加入帶酶的二抗，與待測(cè)一抗結(jié)合；
洗去多余未結(jié)合的二抗，加入酶底物使酶顯色，用儀器（ELISA讀數(shù)器）測(cè)定塑料板中的吸光度值（OD值），評(píng)價(jià)顯色終產(chǎn)物的含量，從而測(cè)定抗體被測(cè)試內(nèi)容。

競(jìng)爭(zhēng)法

競(jìng)爭(zhēng)法是一種不太常用的ELISA檢測(cè)機(jī)制，一般用于檢測(cè)小分子抗原。操作步驟如下：

將特異性抗體固定在塑料孔板上，完成后洗掉多余的抗體；
添加待測(cè)樣品，使樣品中的待測(cè)抗原與塑料孔板上的抗體特異性結(jié)合；
添加帶有酶的抗原，該抗原也可以與塑料孔板上的抗體特異性結(jié)合。由于固定在塑料孔板上的抗體數(shù)量有限，當(dāng)標(biāo)本中的抗原量較多時(shí)，帶有酶的抗原能結(jié)合的固定抗體就較少，即兩種抗原都競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合塑料孔板上的抗體，這就是所謂競(jìng)爭(zhēng)法的由來(lái)；
用酶洗去樣品和抗原，加入酶底物使酶顯色。當(dāng)樣品中抗原的量越多時(shí)，說(shuō)明塑料孔板中殘留的帶酶的抗原越少，顏色就越深。淺的。

當(dāng)需要檢測(cè)無(wú)法獲得兩種以上抗體的抗原，或者難以獲得足夠的純化抗體固定在孔板上時(shí)，一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA。

進(jìn)步

親和素是一種糖蛋白，一分子親和素可與四個(gè)生物素小分子產(chǎn)生特異的親和力，類似于抗原和抗體的親和力。它們之間的作用力是已知比較好的非共價(jià)相互作用。 20世紀(jì)80年代后，隨著生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）的發(fā)現(xiàn)，這種親和力被應(yīng)用到ELISA技術(shù)中，大大提高了后者反應(yīng)的靈敏度和特異性。生物素很容易與蛋白質(zhì)（如抗體等）共價(jià)結(jié)合。這樣，與酶結(jié)合的親和素分子與與特異性抗體結(jié)合的生物素分子發(fā)生反應(yīng)，不僅起到多級(jí)放大作用，而且遇到相應(yīng)的酶時(shí)，會(huì)因酶的催化作用而變色。底物，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。未知抗原（或抗體）分子的用途。

結(jié)果判定

定性測(cè)定

定性判定的結(jié)果是對(duì)待測(cè)樣品中是否含有待測(cè)抗原或抗體給出“是"或“否"的簡(jiǎn)單回答，分別表示為“陽(yáng)性"和“陰性"。 “陽(yáng)性"表示樣本在檢測(cè)系統(tǒng)中出現(xiàn)反應(yīng)。 “否定"意味著沒有反應(yīng)。通過(guò)定性判斷方法也可以獲得半定量結(jié)果，即用滴度來(lái)表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其本質(zhì)仍然是定性檢測(cè)。在這種半定量測(cè)定中，樣品經(jīng)過(guò)一系列稀釋后進(jìn)行測(cè)試，產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為效價(jià)。根據(jù)滴度可以判斷樣品的反應(yīng)活性，這比通過(guò)觀察未稀釋樣品的顏色深淺來(lái)判斷強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性更具定量意義。
在間接和夾心 ELISA 中，陽(yáng)性孔比陰性孔更暗。相反，在競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 中，陰性孔比陽(yáng)性孔更暗。

定量測(cè)定

ELISA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)的因素較多。特別是固相載體的包被很難達(dá)到個(gè)體間的一致性。因此，在定量測(cè)定時(shí)，每批測(cè)試必須使用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)。在此條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。夾心ELISA用于測(cè)定大分子量物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線最高點(diǎn)吸光度可接近2.0。常采用半對(duì)數(shù)值作圖，以供試品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。將濃度值逐點(diǎn)連接，得到的曲線一般呈S形，頭部和尾部曲線趨于平坦，中部較為平直的部分是好的檢測(cè)區(qū)域。
小分子量物質(zhì)的測(cè)定常用競(jìng)爭(zhēng)法，標(biāo)準(zhǔn)曲線中的吸光度與被測(cè)物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀根據(jù)試劑盒中使用的模式略有不同。注意ELISA測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線中橫坐標(biāo)為對(duì)數(shù)關(guān)系，更有利于測(cè)定體系的表達(dá)。

故障排除

1. 顏色很淺或沒有顏色

(1)底物成分漏加、底物失效、底物配制濃度計(jì)算錯(cuò)誤；
（2）整個(gè)ELISA過(guò)程中存在抗原或抗體不匹配的情況；
(3)整個(gè)ELISA過(guò)程中樣品過(guò)度稀釋；
(4)稀釋系統(tǒng)錯(cuò)誤，如使用含蛋白質(zhì)的試劑進(jìn)行包被。

2、全板正極

(1)酶標(biāo)抗原或抗體濃度過(guò)高，嘗試降低濃度；
(2)使用的封閉試劑不正確或未封閉；
（3）酶標(biāo)抗原或抗體與系統(tǒng)中其他試劑結(jié)合；
(4)底物被酶標(biāo)抗原或抗體污染。

3.顯色不均勻

(1)如果ELISA板存在質(zhì)量問題，重新檢查ELISA板的同質(zhì)性；
(2)在涂覆或加樣過(guò)程中，某些孔漏氣或加得少，可能是操作者不小心，或移液器漏氣；
(3)加樣時(shí)移液器內(nèi)注入過(guò)多氣泡；
（4）購(gòu)買的ELISA板不正確，可能誤選其他用途的板；
(5)培養(yǎng)過(guò)程中平板疊放過(guò)厚；
（6）樣品添加或稀釋過(guò)程中試劑混合不充分，或稀釋梯度計(jì)算錯(cuò)誤；
(7)洗板不當(dāng)，有的孔未充滿洗液或加洗滌劑后洗液未充分混合，或洗板過(guò)程中帶入氣泡。

4、上色太快

(1)酶標(biāo)抗原或抗體濃度過(guò)高；
(2)某種試劑濃度過(guò)高。

5、上色太慢

(1)酶標(biāo)抗原或抗體濃度過(guò)低，或標(biāo)記效率低，或標(biāo)記后影響免疫活性；
(2)試劑被污染，如HRP酶標(biāo)抗原或抗體被疊氮hua鈉污染；
(3)反應(yīng)溫度太低；
(4)底物緩沖液的pH值不正確。

6.深色背景

(1)酶標(biāo)抗原或抗體濃度過(guò)高；
(2) 抗體的非特異性結(jié)合；
（3）抗原、抗體不純；
(4)二抗的物種交叉識(shí)別。