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如何定量檢測cAMP和cGMP

更新時間:2023-07-05      點擊次數(shù):1470
1958年Sutherland發(fā)現(xiàn)了cAMP(環(huán)磷酸腺苷),并因此獲得了1971年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎[1].1963年Ashman發(fā)現(xiàn)了cGMP(環(huán)磷酸鳥苷)[2]。50年過去了,人們已明白cAMP、cGMP是在很多生理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的第二信使分子。鳥苷酸環(huán)化酶可將GTP催化生成cGMP,cGMP可以被磷酸二酯酶水解成GDP。激活鳥苷酸環(huán)化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加細胞內(nèi)cGMP的含量。cGMP特異性磷酸二酯酶的抑制劑被用來治療人類的某些疾病,比如cGMP特異性磷酸二酯酶類型5的抑制劑被用來治療ED(勃起功能障礙);腺苷酸環(huán)化酶將ATP催化生成cAMP,cAMP可以被磷酸二酯酶水解成ADP。激活腺苷酸環(huán)化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加細胞內(nèi)cAMP的含量。腺苷酸環(huán)化酶激活受體的阻斷劑和cAMP特異性磷酸二酯酶的抑制劑被用來治療人類的某些疾病,比如針對升高cAMP水平的b-腎上腺素受體的阻斷劑被用于治療心律失常、高血壓心肌梗塞和心力衰竭等疾病。


在五十年的研究歷程中,從開始研究cAMP,cGMP在各種生理過程中的調(diào)節(jié)作用,到近幾年與之相關(guān)的藥物研發(fā),藥物篩選領(lǐng)域,人們一直在努力尋找一種快速、靈敏、特異性和可重復(fù)地定量檢測cAMP和cGMP含量的方法。

檢測方法演變

cAMP,cGMP分子量分別只有329.21和345.21,在機體內(nèi)的含量極低,為p mol/L級別,用一般的分析方法無法測定。70年代一系列測定cAMP和cGMP的方法被發(fā)明出來,最基本的原理有三種:分別是競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法[3]、放射性免疫分析法[4]和薄層色譜法[5]。在80年代,放射性免疫分析法得到了廣泛的應(yīng)用和改進,由于這種方法采用放射性核素標記,應(yīng)用范圍受到一定限制,為了進一步提高檢測的靈敏度和操作的安全性,進入90年代又陸續(xù)發(fā)明了各種酶標記法和化學(xué)發(fā)光法的競爭性ELISA檢測試劑盒,這一類檢測方法的根本原理都是基于抗體抗原的免疫反應(yīng),所有這些試劑盒中采用的抗體全部是兔抗血清或者是經(jīng)過特異親和提純之后的抗cAMP或cGMP的兔多抗,毫無疑問,兔多抗在約四十年的cAMP,cGMP定量檢測中做出了巨大貢獻,但同時它也有著明顯的缺陷:

1,兔多抗對cAMP,cGMP的特異性不高,會與其他核苷類似分子發(fā)生交叉反應(yīng),盡管可以通過特異親和提純降低交叉,但仍然無法消除交叉;

2,兔多抗對cAMP和cGMP的親和力受高濃度的二價陽離子(比如Mg2+和Ca2+)的影響;

3,兔多抗在制備的過程中存在個體差異和批間差異,難以保證檢測數(shù)據(jù)的重復(fù)性;

4,兔多抗試劑盒在cAMP,cGMP樣品的處理上也需要進行乙?;幚恚@與兔多克隆抗體制備方法有必然關(guān)系,如果不乙酰化將無法達到檢測所需的靈敏度。

所以無論標記方法如何革新,不改進抗體,仍然不能從根本上迎來cAMP,cGMP定量檢測的變革。

cAMP和cGMP單克隆抗體成功開發(fā)

NewEast Biosciences(紐斯特)公司的科學(xué)家經(jīng)過兩年的研發(fā),篩選了4萬多個克隆,終于從中發(fā)現(xiàn)了高特異性,高親和力的cAMP和cGMP單克隆抗體。并成功構(gòu)建了基于單抗的cAMP和cGMP ELISA檢測試劑盒。這個cAMP(cGMP)單抗對非乙酰化的cAMP(cGMP)的特異性識別能力是其對cGMP(cAMP)、ATP(GTP)以及其他核苷類似物識別能力的108倍以上,這相比于以往的多抗試劑盒大大提高了cAMP (cGMP) 檢測的靈敏性和特異性,并且極大的降低了試劑盒的批間差異,提供了長久有效地可重復(fù)性檢測,也擺脫了繁瑣的乙?;^程和對科研人員健康不利的乙?;瘬]發(fā)試劑。




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